Клепиков А. А., Шамцян  М. М.

ЛАККАЗЫ ВЫСШИХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

Санкт-Петербургский Государственный Технологический Институт      (Технологический Университет)

This work on the enzyme laccase, obtained by using higher bazidealnyh fungi. And also about the possible applications of this enzyme.
Key words: laccase, enzyme, basidiomycetes.

Эта работа о ферменте лакказе, получаемой с помощью высших базидиальных грибов. А также о возможных областях применения данного фермента.

Ключевые слова: Лакказа, фермент, базидиальные грибы.

Лакказы являются одними из основных лигнолитических ферментов. Подавляющее большинство лакказ относится  к так называемым «голубым» медьсодержащим белкам, способным восстанавливать молекулярный кислород непосредственно до воды без образования в качестве промежуточного продукта перекиси водорода или каких либо других кислородных интермедиатов.

Каталитические и электрокаталитические свойства лакказ дают возможность их широкого использования в различных сферах, таких, как делигнификация бумажной пульпы в целлюлозно-бумажной промышленности; создание биосенсоров; детоксикация и обесцвечивание сточных вод; пищевая промышленность;  отбеливание тканей; органический синтез; производство моющих средств; косметическая промышленность и другие области.

Лакказы обнаружены у многих возбудителей мягкой гнили, почвенных сапротрофных и фитопатогенных грибов (аскомицетов или их гифомицетных анаморфов), у большинства трутовиков - возбудителей белой гни­ли, а также у многих агариковых грибов, растущих на почвенном или рас­тительном субстрате, включая наиболее широко культивируемые съедоб­ные грибы - культурный шампиньон, вешенку, рисовый гриб [1]. Способность продуцировать лакказы обнаружена также в растениях, однако для промышленного применения пригодны только высоко редокс-потенциальные лакказы, синтезируемые лигнолитическими ксилотрофами, относящимися к классу Basidiomycetes. Базидиальные грибы, как продуценты, имеют ряд преимуществ перед другими организмами. Эти грибы способны расти на легкодоступных питательных средах, включая отходы некоторых производств. Поэтому в качестве продуцентов лакказ нами были выбраны именно базидиальные грибы.

Объектом исследования служили штаммы  культур базидиальных грибов: Bjerkandera, Coprinus, Fumitopsis, Cerrena, Panus, Grifola, Ganoderma, Pleurotus, Hypsizigus, Pyptopurus, Pleurotus, Coriolus, Ganoderma, Panus, Trametes, Coriolus, Pleurotus, Fomes, Oligoporus, Corticium, Hapalopilus, Ceriporiopsis, Skeletocutis, Antrodiella, Funalia. Чистые культуры базидиальных грибов из коллекции кафедры ТМС СПбГТИ(ТУ), а также выделенные самостоятельно в чистую культуру.

Скрининг штаммов на наличие оксидазной активности. Штаммы из пробирок пересевали на  агаризованную  среду в чашки Петри. Агар с растущей культурой (8 мм в диаметре) вырезали из чашек Петри и вносили в чашку Петри (в 3-х последовательностях), содержащую твердую агаризованную среду с галловой кислотой (0,4%) (метод Бавендамма [3]) и параллельно на агаризованной глюкозо-аммонийной среда с пирокатехином (0,12%) (модифицированный метод Бавендамма [2]), и инкубировали 6 суток. Культуры, образующие наибольшие по диаметру окрашенные зоны (проявление оксидазной активности), отбирали для дальнейших исследований.

Для отбора штаммов, обладающих наиболее высокой оксидазной активностью, проводили глубинное культивирование грибов. Оксидазную активность в культуральной среде определяли спектрофотометрически при 400 нм с использованием пирокатехина в качестве субстрата.

В результате проведённого в два этапа скрининга был отобран в качестве наиболее перспективного продуцента лакказы штамм гриба рода Funalia. Данный гриб показал наибольшую оксидазную активность в культуральной среде без добавления индукторов, равную 2,4 EoA. Выращивание отобранного штамма, проводилось методом глубинного и поверхностного культивирования.

Преимуществом глубинного культивирования по сравнению с поверхностным способом, является возможность перехода на непрерывный способ культивирования, создание благоприятных условий для доступа кислорода и питательных веществ ко всем клеткам мицелия, обеспечение коротких сроков культивирования, асептичность условий и т. д. В настоящее время проводится подбор индукторов синтеза лакказы, а также компонентов питательной среды для увеличения выхода фермента. Уже на данном этапе удалось повысить активности фермента до 8,8 EoA на пятые сутки культивирования, за счёт применение в качестве индуктора солодовых ростков и катионов меди (CuSO4).

 Изучается также возможность получения лакказы методом  поверхностного культивирования базидиальных грибов рода Funalia на среде включающей в качестве основных компонентов  древесные опилки и солодовые ростки. Данный метод позволит получать ценный фермент из доступного и дешёвого сырья.

Литература:

1. Рабинович М. Л., Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. – М. : Изд. Наука, 2002. - 344 с.

2. Русинова, Т. В. Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами рода Trametes : автореф. дис. канд. хим. наук / Т. В. Русинова ; Моск. гос. унив. инжен. энзим. – М. : Изд. Унив., 2007. - 20 с.

3. Uber das Vorkommen und den Nachweis von Oxydasen bei holzzerstorenden Pilzen / W. Bavendamm // Ztschr. Pflanzenkh. und Planzenschutz Bd. – 1928. - № 38. – P. 257-276.